Otro personaje que vivió en esta casa fue Diego de Espina, intendente de Felipe II, aunque sin duda su hijo Juan de Espina se convertiría en el más "célebre y enigmático personaje" de esta dinastía y de cuantos habitaron el palacio en toda su dilatada historia.

Don Juan de Espina nació en Ampuero el primero de agosto de 1563; aunque en su juventud se dedicó "a las armas", su auténtica vocación fueron las artes y la ciencia, y especialmente la música. En su casa llegó a reunir un maravilloso museo tanto de obras de arte como de los objetos más dispares, entre los que se contaban: animales exóticos disecados, piezas diminutas de marfil, instrumentos musicales, cuadros de grandes maestros, joyas y los artificios mecánicos más extravagantes. José María de Cossio realizó en Rutas Literarias de la Montaña una extensa investigación sobre este curioso personaje que adquirió al final de su vida fama de nigromante y de persona solitaria y misteriosa.

Muchos fueron los autores de la época que escribieron acerca de Don Juan de Espina y de su casa de La Bárcena. El mismo Francisco de Quevedo trazó una semblanza elogiadora de este ampuerense, calificándole de "caballero montañés de muy conocida calidad, y solar de aquella cuna de la hidalguía de España muy esclarecido". El dramaturgo José Cañizares lo convirtió en personaje central de una de sus comedias en la que se finge un diálogo entre don Juan y el Rey Felipe IV.

También son numerosos los testimonios acerca de su fabuloso museo. Don Alonso del Castillo Solórzano había de dirigirle un romance con el fin de obtener permiso para visitar su casa, lo cual era dificil de conseguir.

El pintor Vicencio Carducho evidenció la riqueza de las obras de arte que Juan de Espina poseía: "Tiene cosas singularísimas y dignas de ser vistas de cualquier persona docta y curiosa. Allí vi dos libros dibujados y manuscritos de mano del gran Leonardo de Vinci, de particular curiosidad y doctrina..."